單細胞蛋白質組學（single-cell proteomics, SCP）是一種專注于解析單個細胞中蛋白質組成和功能的前沿分析技術。單細胞蛋白質組學能夠提供更細致的細胞層面信息，有效揭示單細胞之間的內在異質性，與傳統的大規模蛋白質組學相比，彌補傳統方法僅提供樣本總體或平均表達水平的不足。在植物研究中，單細胞蛋白質組學突破了因細胞壁結構導致傳統技術難以解析單一植物細胞蛋白質的局限性，可揭示植物細胞間異質性，深入解析植物基因調控網絡和細胞功能特性。基于此，2024年愛荷華州立大學研究團隊以擬南芥為模型，通過單細胞蛋白質組學技術成功區分了根部內胚層和皮層細胞，為植物單細胞研究提供了理論依據和技術支持。作為專業服務商，百泰派克生物科技利用全流程集成自動化的單細胞分選平臺——CellenONE，為科研人員提供高質量、精準的單細胞蛋白質組學分析服務，為解決植物研究中復雜細胞異質性問題提供創新解決方案。

擬南芥是植物學中常用的模式植物，因其根系細胞類型明確且分布規律，成為研究植物細胞異質性的理想模型。根系是植物重要的吸收和運輸器官，其不同細胞類型在生理功能和響應外界刺激上各有不同。傳統的蛋白質組學方法無法精確區分根系中不同細胞類型之間的蛋白質表達差異，而單細胞蛋白質組學為此提供了一種創新的解決方案。愛荷華州立大學研究團隊通過對擬南芥根細胞類型的單細胞蛋白質組分析，為深入理解植物根系的功能分化及其在環境適應中的作用提供了理論依據，以下是其主要研究結果：

一、方法學改進及數據質量評估

擬南芥的根是一個特征明確的器官，具有明確的細胞類型，使其成為植物SCP基準的優秀系統。選擇關注兩種細胞類型，皮層和內胚層，這兩種細胞來源于一種常見的干細胞譜系。在根內，這兩種細胞類型在物理上彼此相鄰（圖1）。根部被酶解釋放原生質體，然后分別用流式細胞儀分離內胚層或皮層原生質體。最終，每種細胞類型的384個原生質體放置在384孔板上。

圖1. 擬南芥內胚層和皮層單細胞蛋白質組學方法

使用改進的方法進行前處理和標記上機，分析756個單個細胞。所得到的原始數據最初使用MaxQuant進行搜索，評估了數據的靈敏度和一致性（圖2）。最終鑒定了3763個蛋白質，平均每個細胞1118個蛋白質。

圖2. 單細胞蛋白質組學數據評估

計算肽變異系數（CV），并去除具有極端肽CV（> 0.69）的細胞。還去除了在< 98%的細胞中定量的蛋白質，以生成嚴格的過濾列表。雖然這種嚴格的過濾將細胞數量減少到81個（33個內胚層細胞和48個皮層細胞），但能夠在這些細胞中量化3217個蛋白質。推測這可能是由于根細胞大小的差異（每個細胞的總蛋白）導致的，因為沿著根的長度存在細胞大小的梯度。此外，包括根在內的許多植物組織中的細胞都經歷了基因組內重復。雖然這通常會導致細胞變大，但細胞大小的增加是非線性的，這表明在植物SCP研究中，鑒定組蛋白以外的正常化因子是必要的。細胞大小可變性可能導致定量變化的問題也可以在未來使用能夠不僅基于熒光而且基于細胞大小/形態進行分選的儀器進行研究，例如cellenONE。

二、數據檢查

對定量蛋白進行檢測，以探索SCP檢測到的蛋白的特征。首先觀察SCP是否檢測同源轉錄物高度豐富的蛋白質。繪制了擬南芥根系單細胞RNA-seq圖譜中檢測到的轉錄本，發現在SCP中檢測到的蛋白質跨越了低到高豐度轉錄本的范圍，并偏向于豐富的轉錄本。最后，檢查了SCP是否量化與信號相關的蛋白質，這些蛋白質通常含量較低。具體來說，檢查了是否量化了激酶和轉錄因子。在3217個定量蛋白中，觀察到175個激酶和188個轉錄因子，表明信號相關蛋白很容易通過SCP測量。

三、結果分析

接下來，研究了嚴格過濾組的內胚層和皮層細胞蛋白質組的差異。前25%最易變蛋白的PCA和UMAP顯示了內胚層和皮層細胞之間的明顯分離（圖3）。

圖3. PCA和UMAP圖

還進行了差異表達分析，并鑒定出596種蛋白在內胚層和皮層細胞中差異積累(圖4a)。在預期的細胞類型中觀察到已知蛋白的富集（圖4a）。例如，CASPARIAN STRIP MEMBRANE DOMAIN PROTEIN 1在內胚層細胞中富集，這與它作為參與CASPARIAN STRIP （CS）形成的內胚層標記物的已知作用一致。此外，YUCCA 2中的NAKED PINS在內胚層細胞中富集，據報道，它可以控制PIN-FORMED 1亞細胞的基底定位和根向地性反應。研究還發現了內胚層細胞富含呼吸爆發氧化酶同源物D，已知在內胚層細胞中激活活性氧依賴的信號以幫助CS形成。

圖4. 差異表達分析

在皮層內，幾個關鍵的標記蛋白被富集。這包括生長素反應因子5，已知其可驅動皮質細胞分裂。共伴侶蛋白P23-1也在皮質細胞中富集，該蛋白在建立生長素分布和維持皮質細胞適當數量方面發揮了重要作用。最后，研究發現蛋白酶體19S調節顆粒8a在皮質中富集，已知它可以影響BRAHMA的穩定性，從而促進硼耐受性。為了識別兩種細胞類型中鑒定的蛋白質之間的共同和獨特特征，對兩種細胞類型（列）和蛋白質（行）進行了分層聚類（圖4b）。該分析顯示，來自內胚層的細胞傾向于聚集在一起，來自皮層的細胞也是如此，這表明基于細胞起源的明顯聚類（圖4b）。

近年來，樣品制備、液相色譜和質譜技術的進步顯著提高了單細胞蛋白質組的檢測能力，將蛋白質檢測能力從幾百個提高到幾千個。在這一背景下，愛荷華州立大學研究團隊成功地利用單細胞蛋白質組學分析了擬南芥根部不同細胞類型的蛋白質表達譜，結果表明單細胞蛋白質組可區分擬南芥根細胞類型，這不僅證明了單細胞蛋白質組學在植物中的可行性，也揭示了植物根部細胞類型間復雜的蛋白質調控機制。

作為一家專注于生物制品表征和多組學生物質譜檢測的高品質服務商，百泰派克生物科技致力于為客戶提供專業的單細胞蛋白質組學分析服務。憑借豐富的經驗和先進的技術，我們為植物研究提供高質量的數據支持。無論是深入解析植物細胞類型，還是精準測定復雜生物體系中的蛋白質表達差異，百泰派克生物科技都能為您量身定制解決方案，助力您的科研突破。

參考文獻：Montes C, Zhang J, Nolan TM, Walley JW. Single-cell proteomics differentiates Arabidopsis root cell types. New Phytol. 2024 Dec;244(5):1750-1759. doi: 10.1111/nph.19923. Epub 2024 Jun 24.

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