糖系統常用色譜柱
????????色譜柱是HPLC分離過程的核心,針對糖分析,不同的色譜柱直接決定分離的對象、過程和效果。分離糖類常用的色譜柱有:凝膠柱、C18柱(衍生化)、氨基柱和糖分析柱。這些色譜柱分離原理不同,使用的條件也各不相同,在對于糖分析的應用,見下表。
????????????????????????????????????????????????????糖分析色譜柱應用對比
色譜柱 | 分離原理 | 常用流動相 | 方法建立 | 分析對象 |
凝膠柱 | 分子排阻 | 水/緩沖介質 | 簡單 | 多糖、高聚糖 |
氨基柱 | HILIC模式(反反相) | 乙腈/水 | 較復雜 | 單糖、二糖、低聚糖 |
糖分析柱 | 配位體交換 | 高比例水 | 簡單 | 單糖 |
C18柱 | 反相 | 不限 | 復雜 | 單糖 |
凝膠柱
????????樣品進入凝膠柱后,在一定孔徑的凝膠顆粒中擴散,按照分子篩效應,大分子較快洗脫出小分子較慢洗脫出來。由于這樣的分離原理,限制了相同或相近分子量的碳水化合物不能實現很好分離,所以凝膠柱常用于大分子的多糖或者高聚糖的分離檢測。
C18柱
????????C18柱,實驗室最常見色譜柱,價格低廉,使用注意事項少。碳水化合物一般易溶于水,極性較高,所以在C18柱上沒有很好的保留。但是可以通過衍生化提高碳水化合物的疏水性,搭配紫外檢測器,就可以使用C18柱進行分析檢測,適合于痕量分析。
氨基柱
????????氨基柱在分析碳水化合物時采用的是HILIC模式,這樣的分離模式決定了氨基柱比較適合較小分子糖的分離,可適用于分離同時含有單糖、二糖、三糖等不同聚合度的混合糖分子的樣品。氨基柱的鍵合相氨丙基易水解,所以氨基柱的使用壽命較短,使用注意事項相對較多。酸性或高比例水相條件會加速水解,因此氨基柱應避免在酸性或者高水相的流動相中使用。當樣品顯酸性的時候,可在流動相中略微添加少許氨來提高氨基柱柱效和壽命。
糖分析柱
????????糖分析柱簡稱糖柱,采用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基質,金屬離子對為官能團,二者通過磺酸基鍵合作為填料。分離時,低交聯度的樹脂允許糖的透過,并且按尺寸大小進行分離表現為尺寸排阻作用,同時碳水化合物上的羥基與樹脂的金屬對離子形成結合體而被保留,表現為配位體交換作用。由于這種特殊的分離機制決定了糖柱更擅長分析單糖,對于結構復雜、分子量大的碳水化合物分離效果稍差。德國諾爾糖分析柱特殊工藝不僅可以適用于聚合度小于8的糖分析,還可適用于糖醇及有機酸類物的分析檢測。糖柱分離條件簡單,樣品制備工作量小,可直接使用水洗脫,因此糖柱很容易建立分離糖類物質的方法。但是糖柱特殊的基質所以使用時常需要較高柱溫(60~80℃),一般液相柱溫箱只能達到65℃,而諾爾AZURA系統液相的柱溫箱可達到85℃,無需額外配置柱溫箱就可達到所需色譜條件進行糖檢測,非常簡便快速。
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