隨著生物技術的發展,核酸檢測得到了人們越來越多的重視,它可直接檢查HIV RNA,可在發現血清學變化之前檢測HIV感染,而且比P24抗原檢測方法更靈敏。簡單的說就是病毒感染人體后，一般情況下可通過一系列檢測被發現，而最早能被檢測到的是病毒核酸。現有的酶聯免疫等血清學檢測方法檢測的是抗原或抗體，而核酸檢測技術檢測的是病毒核酸，所以能更早地發現病毒感染。正常42天左右血液才能檢測到HIV病毒，HIV核酸檢測將艾滋病病毒的檢測“窗口期縮短至11天。并且核酸檢測這項技術可將乙肝、丙肝病毒的檢測“窗口期”分別由原來的50天、72天縮短到25天、59天。血液安全由此可得到更好保障。

HIV核酸定性檢測

1.1 方法和試劑

1.1.1 方法：（1）檢測方法為商品化試劑盒和實驗室自建方法，商品化試劑應嚴格按說明書操作。下面介紹的方法是實驗室自建方法，供參考。（2）檢測血漿或血清樣品使用逆轉錄PCR（RT-PCR）方法，建議第一輪PCR擴增使用RT-PCR一步法；檢測血細胞或組織樣品使用PCR方法。一般使用擴增兩輪的套式PCR方法。（3）設立陽性、陰性及空白對照。陽性對照為與待測樣品同質、含有目的基因的樣品；陰性對照為與待測樣品同質、不含有目的基因的樣品。陽性和陰性對照樣品應與待檢樣品處理程序一致。陰性對照的設置數量應根據實驗樣品的數量設置在不同的位置。

1.1.2 試劑：（1）PCR引物：一般使用擴增HIVgag和/或pol和/或env和/或LTR等引物。進行RNA逆轉錄時可使用下游特異性引物或隨機引物。引物設計可參考文獻或自行設計，應盡量涵蓋常見的HIV流行毒株，也可使用兼并性引物。（2）主要試劑：包括核酸提取純化、逆轉錄、PCR所需的試劑。使用商品化核酸提取純化試劑、逆轉錄酶反應試劑和PCR擴增試劑。（3）抗污染試劑：實驗室自建檢測方法可使用抗污染試劑，參考尿嘧啶DNA糖基化酶抗污染方法。

1.2 擴增目的基因片段

1.2.1 樣品的采集和處理

1.2.2 核酸提取：可使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法以及自動化儀器等商品化試劑或設備并按說明書操作。提取RNA時應注意防止RNA降解。DNA應置于-20℃保存，RNA和需長期保存的DNA應置于-80℃保存。

1.2.3 逆轉錄合成cDNA：使用商品化試劑并按說明書操作。逆轉錄cDNA合成反應需使用逆轉錄引物、dNTPs、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴增儀或水浴箱中，在規定的溫度和時間下進行逆轉錄反應。建議使用商品化RT-PCR一步法試劑進行第一輪擴增反應。

1.2.4 PCR擴增反應：使用商品化試劑按說明書操作。PCR反應需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、緩沖液、和適量無RNA/DNA酶超純水、以及模板（DNA或cDNA）。在擴增儀中，按照設定的程序進行擴增。一般使用二次擴增的套式PCR擴增方法。

1.3 擴增產物分析及結果報告

1.3.1 擴增產物分析：擴增產物常用分析方法是瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標準比較，判斷擴增片段是否在預期的分子量范圍內。其它擴增產物分析方法還有限制性內切酶酶切分析、特異性探針雜交分析以及DNA序列分析等。自動化核酸擴增儀使用酶聯比色分析或熒光探針雜交等原理測定。

1.3.2 結果判定和報告：（1）實驗成立的條件：每一次檢測需同時做兩個陽性對照、兩個陰性對照，只有陽性對照擴增出預期的片段、陰性對照沒有擴增出任何片段、雙份平行樣品結果一致的情況下實驗才成立，可以作出核酸陽性或陰性反應結果的判定。（2）HIV核酸檢測陽性：使用商品化檢測試劑，發現核酸陽性反應，應該重復采集樣品進行復測，復測結果呈核酸陽性反應則判定為核酸陽性，復測結果為核酸陰性反應則判為不確定結果，需進一步隨訪檢測。（3）HIV核酸檢測陰性：只可報告本次實驗結果陰性。（4）應在完成檢測后7個工作日內發出檢測報告。

HIV核酸定量檢測

2.1 方法

HIV核酸定量檢測主要基于靶核酸擴增RT-PCR和信號放大擴增兩種方法。國內常用的方法中，NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1采用國際單位（IU/ml），與NASBA的拷貝數關系基本為1:1；Amplicor Cobas 的拷貝數約為1.2～1.5國際單位；bDNA方法的拷貝數約為0.8～1.0國際單位。不同方法的關系與HIV的亞型有關。

2.2 試劑

必須使用經中國藥品生物制品監督管理局注冊批準的商品化試劑并嚴格按說明書操作。

2.2.1 靶核酸擴增試劑和性能：

（1）RT-PCR擴增試劑

1）Amplicor HIV-1 Monitor v1.5（RT-PCR微孔板捕獲比色分析法），核酸手工提取（異丙醇沉淀），比色分析測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，可擴增HIV-1M組的A-K基因亞型。標準法的檢測線性范圍是400～750，000；超敏法的線性范圍是50～100，000 RNA拷貝/毫升。

2）COBAS Amplicor HIV-1 Monitor v1.5, 核酸手工提取（異丙醇沉淀），儀器測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，可擴增HIV-1M組的A-H基因亞型。標準法的檢測線性范圍是400～750，000；超敏法的線性范圍是50～100，000 RNA拷貝/毫升。

3）COBAS AmpliPrep/COBAS Amplicor HIV-1 Monitor v1.5 （COBAS Amplicor 分析儀）,儀器提取核酸，儀器測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，可擴增HIV-1M組的A-H基因亞型。標準方法的檢測線性范圍是400～1，000，000；超敏方法的線性范圍是50～100，000 RNA拷貝/毫升。

以上三種試劑均采用基于PCR擴增靶核酸檢測法，僅在設備的使用、自動化程度和樣品制備的方法有所不同。

4）COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test（實時熒光探針RT-PCR分析法）, 儀器提取核酸,實時熒光探針PCR擴增儀器測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，可擴增HIV-1M組的A-H基因亞型。檢測線性范圍是40～10，000，000 RNA拷貝/毫升，比上述三種方法的檢測線性范圍要寬，樣品可不經稀釋一次完成檢測。

以上四種試劑均使用一個內部定量標準品，1個陰性、1個弱陽性和1個強陽性外部外部質控品。均使用dUTP/UNG防污染試劑。

5）LCx HIV RNA Quantitative Assay（競爭性RT-PCR微顆粒酶免疫分析法）,手工或儀器提取核酸（活化硅膠柱純化），儀器測定。擴增靶核酸位置是pol（整合酶）基因區，可擴增HIV-1基因M組的A-G亞型和0組病毒，尤其可檢測M組C基因亞型和一些重組病毒。檢測線性范圍是50～1，000，000 RNA 拷貝/毫升；使用一個內部定量標準品和六個外部定量標準品。

6）RealTime HIV-1 Assay（實時熒光探針RT-PCR分析法）,使用獨特的雙鏈熒光探針。手工或儀器提取核酸（磁性顆粒純化），儀器測定。擴增靶核酸位置是pol（整合酶）基因區，擴增HIV-1基因亞型是M組的A-G亞型和0組以及N組病毒。檢測線性范圍是40～1，000，000 RNA 拷貝/毫升。使用一個內部定量標準品。檢測結果與LCx HIV RNA Quantitative Assay結果高度相關。

（2）基于核酸序列擴增試劑（NASBA擴增技術）：以等溫方式直接擴增HIV-1 RNA。

NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1（實時熒光探針分析法）, 使用熒光標記的分子信標探針技術檢測擴增子。手工或儀器提取核酸（硅膠純化，異丙醇沉淀）,儀器測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，擴增HIV-1基因亞型是M組的A-G亞型。檢測線性范圍是50～3，000，000 RNA 國際單位/毫升；使用一個內部定量標準品，沒有陰陽性外部外部質控品。每次檢測8的整數倍樣品，直至48個。檢測結果與Versant HIV-1 RNA、和Amplicor HIV-1 Monitor v1.5 方法的結果有著高度的相關性。國際上已經推薦使用V2.0試劑盒。

2.2.2 信號放大擴增試劑和性能

Versant HIV-1 RNA 3.0.bDNA（分枝狀DNA探針雜交微孔板捕獲比色分析法）, 利用分枝狀DNA多級信號放大原理。無需RNA純化和PCR擴增步驟。離心濃縮病毒子并用去垢劑和蛋白酶K消化病毒釋放病毒RNA，儀器測定。擴增靶核酸位置是pol基因區，擴增HIV-1基因亞型是M組的A-H亞型，檢測線性范圍是50～500，000 RNA 拷貝/毫升；使用六個外部定量標準品，1個陰性、1個弱陽性和1個強陽性外部外部質控品。每次可檢測12的整數倍樣品。

以上試劑均可使用EDTA和ACD作為樣品的抗凝劑，NucliSens HIV-1 QT和NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1以及Versant HIV-1 RNA 3.0.bDNA試劑還可以使用肝素作為抗凝劑。如果必須使用經肝素處理的血漿樣品進行RT-PCR擴增，則必須在樣品中直接加肝素酶消化肝素。

2.2.3 實時熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

實時熒光定量PCR擴增的實驗檢測過程可分為：（1）樣品制備,抽提和濃縮目標RNA分子，并除去可能存在的抑制因子。（2）Real-time PCR，檢測PCR的產物使用熒光標記的寡核苷酸探針。檢測的原理基于熒光信號增長曲線與循環數相關。（3）RT-PCR反應，病毒RNA利用逆轉錄酶將RNA逆轉錄為cDNA，然后通過DNA聚合酶對特定片段進行擴增。（4）擴增產物的檢測，基于檢測閾值的設定，當病毒載量高時，低循環數即能檢測到熒光信號，當病毒載量低時，高循環數時才能檢測到熒光。循環數與樣品載量成線性關系。利用標準品制作循環數與載量的標準曲線就能對樣品載量進行定量檢測。