Illumina助力云南省CDC快速破譯新型冠狀病毒全基因組序列
據(jù)云南廣播電視臺《都市條形碼》微信公眾號報(bào)道，1月21日，國家衛(wèi)生健康委確認(rèn)昆明市首例輸入性新型冠狀病毒感染的肺炎確診病例。云南省疾控中心急性傳染病防制所所長伏曉慶介紹，1月17日中午12點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室收到患者采樣標(biāo)本，下午3點(diǎn)就完成了核酸檢測，結(jié)果呈陽性。
1月18日凌晨1點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室開始病毒全基因組序列測定，20日上午10點(diǎn)測序工作完成，經(jīng)過與國家公布的新型冠狀病毒全基因組序列進(jìn)行比對分析，證明測序結(jié)果與公布的序列高度同源，確證云南發(fā)現(xiàn)病例為新型冠狀病毒感染的肺炎確診病例。伏所長還表示，全基因組測序技術(shù)對于疫情研判、防控方案制定與措施采取，有至關(guān)重要的作用。
圖1：云南CDC技術(shù)專家正在進(jìn)行病毒MiSeq測序前的準(zhǔn)備（圖片來源：云南省CDC提供）
圖2：云南CDC技術(shù)專家正在生物安全柜中進(jìn)行測序文庫樣品的前處理（圖片來源：云南省CDC提供）
圖3：利用Illumina平臺測定的、且在GenBank上公布的新冠病毒全基因組完整序列。（圖片來源：GenBank官方網(wǎng)站）
散彈槍法宏基因組測序（Shotgun metagenomics），即對待檢樣本的直接測序，專用于微生物群落的種屬鑒定及豐度測量。在傳染病領(lǐng)域，這一方法特別對新現(xiàn)病毒具有強(qiáng)大的檢出能力，規(guī)避了常規(guī)病毒分離培養(yǎng)過程可能引入的病毒變異，同時(shí)最大限度壓縮了病原檢出的時(shí)間。病毒是“一包基因”，基因組結(jié)構(gòu)功能變異度高，沒有類似于細(xì)菌16S rRNA序列的分子標(biāo)志物可供統(tǒng)一的進(jìn)化親緣分析。
Jasper F. W. Chan et al. Clin. Microbiol. Rev. 2015； doi:10.1128/CMR.00102-14
圖4：冠狀病毒科進(jìn)化親緣關(guān)系
對于檢測諸如埃博拉、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒，狂犬病毒等形形色色潛伏于環(huán)境或天然宿主中的RNA病毒而言，病毒本身滴度和背景核酸干擾是檢測成功與否的關(guān)鍵之一。核酸富集（Enrichment）與 病毒基因組互補(bǔ)DNA合成兩個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)顯得尤為重要。已發(fā)展出各式技術(shù)、方法用于提高核酸產(chǎn)量。
動物疫源性宿主（Zoonotic reservoirs）在傳播病原的過程中扮演著重要的角色。利用高通量測序能對動物宿主體內(nèi)潛伏的病原進(jìn)行廣譜篩查，已成為實(shí)現(xiàn)關(guān)口前移與治未病先進(jìn)防疫理念倚仗的關(guān)鍵技術(shù)和重要手段。
以蝙蝠為例，所攜帶的病毒種群（組）存在天然的蓄存與流行。不同種類蝙蝠的病毒組有很大差異，其中就包含對脊椎動物具有致病性的病毒種屬，特別是高致病新現(xiàn)病毒，如甲型流感病毒、漢坦病毒、丙肝病毒、SARS樣beta群冠狀病毒、乳頭瘤病毒、細(xì)小RNA病毒等。
雖然本次武漢新冠病毒的來源、傳播途徑問題仍不清楚，但蝙蝠攜帶SARS樣冠狀病毒的發(fā)現(xiàn)早有報(bào)道，He等對268只蝙蝠肛拭子進(jìn)行宏基因組測序，成功鑒定發(fā)現(xiàn)alpha、beta群冠病。其中于云南寶山檢出的SARS樣的冠狀病毒（LYRa11）基因組全序列顯示，它與人類SARS冠病序列一致率高達(dá)91%；尤其是刺突蛋白 人類細(xì)胞受體結(jié)合域（Receptor Binding domain，RBD）編碼序列與人SARS冠病高度近似，且能與SARS病人恢復(fù)期血清發(fā)生免疫反應(yīng)，提示了兩者可能的重組親源關(guān)系。此外，我國科學(xué)家還從蝙蝠體內(nèi)檢出MERS冠狀病毒的近親。
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