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分子檢測定性項目的性能驗證

2021.6.23

為加強新冠病毒核酸檢測能力建設，以更好滿足新冠肺炎疫情常態化防控要求，去年至今各地新建和改擴建的PCR實驗室數量快速增長。雖在每次舉辦的PCR培訓班上我們都會重點講解性能驗證相關內容，但在實驗室現場驗收或督查過程中，仍發現不少實驗室對性能驗證相關知識并不是很清楚。今天就以新冠病毒核酸檢測項目為例，和大家探討一下分子檢測定性項目性能驗證的一些知識，希望能對大家有點幫助。

什么是性能驗證？

對于從事臨床檢測工作的各位來說，性能驗證這個詞應該耳熟能詳。但具體什么是性能驗證？如何做性能驗證？真問起來很多老師也確實沒法準確回答出來。關于性能驗證，IS015189(CNAS-CL02)中將其描述為“在常規應用前,應由臨床實驗室對未加修改而使用的已確認的檢驗程序進行獨立驗證。實驗室應從制造商或方法開發者獲得相關信息，以確定檢驗程序的性能特征。實驗室進行的獨立驗證，應通過獲取客觀證據（以性能特性形式）證實檢測程序的性能與其聲明相符。驗證過程證實的檢驗程序的性能指標，應與檢驗結果的預期用途相關”。很多老師覺得這句子讀起來很是拗口，不好理解。其實簡單來說就是：對于新開展的檢測項目，實驗室需要在本實驗室特定條件下復現商品化試劑說明書中所列出的相關性能指標，如符合率、精密度和靈敏度等。

PS：有些老師還分不清性能驗證和性能確認的區別。性能驗證，驗證的是有證產品；而性能確認，確認的是非標方法，如實驗室自建方法，這兩者是有本質區別的。

為何做性能驗證？

為了驗證實驗室內檢測系統可良好運行，有效保證實驗室檢測質量。

PS：有些老師認為既然試劑有證，就代表它質量可靠，那么實驗室根本沒必要做性能驗證。但需糾正的是，性能驗證并非僅針對試劑，它還包括了人員、儀器、環境等諸多因素，其驗證的是實驗室內一套完整的檢測系統（人、機、料、法、環），因而上述看法是不對的。

何時需做性能驗證？

檢驗程序常規應用前。
任何嚴重影響檢測系統分析性能的情況發生后（包括但不限于儀器主要部件故障、儀器搬遷、設施環境的嚴重失控等），應在檢測系統重新啟用前對受影響的性能進行部分性能驗證。
實驗室增加新的檢測系統時，新的檢測系統包含現用檢測系統的任一要素（儀器、試劑等）變更，如試劑升級、儀器更新等。

PS：新增檢測項目時需做性能驗證，大部分實驗室都很清楚這點。但有些實驗室在新增/變更部分儀器/試劑的情況下，認為僅進行系統間比對即可，這并不符合相關要求，此種情況下也是需按照新系統進行性能驗證。

性能驗證前的準備

操作人員應經過培訓，熟悉所用方法原理與操作。
儀器經過校準，各項性能指標合格。
實驗室設施及環境符合工作要求。
試劑滿足要求。
性能驗證人員應了解驗證方案、制定驗證計劃并組織實施。

PS：然而，在進行性能驗證前，有些實驗室并未按上述要求進行準備。如實驗室無人員培訓記錄，檢測人員無法對性能驗證數據進行現場分析解讀；部分儀器未經校準后即投入使用；實驗室使用兩種檢測試劑（如新冠病毒核酸檢測），但在查看記錄時卻發現兩種試劑性能驗證方案間存在較大差異，問其如何制定性能驗證SOP文件？卻發現實驗室根本就沒相關SOP文件。上述情況下，實驗室如何保證所用檢測系統的性能驗證是合格的？

如何做分子檢測定性項目的性能驗證？

目前合規開展的臨床檢測項目要求使用有證商品化試劑，因而常規使用前都需做性能驗證。雖不同定性項目檢測技術（如PCR、Sanger 測序或NGS等）的性能驗證參數有所側重，但其中最為重要的性能指標（符合率、精密度和檢出限）是必須進行驗證的。但在具體實踐中，仍有不少實驗室對于性能驗證所用樣本類型、樣本數量和具體方案等存在諸多疑惑，下面以新冠病毒核酸檢測項目為例簡單介紹一下。

符合率

驗證要求：通過與參比方法進行比較。參比方法：金標準方法、行業公認方法、經驗證性能符合要求滿足臨床預期用途的方法(如：通過 ISO15189 認可實驗室使用的相同檢測方法)。
驗證方案：

樣本：陰性樣本不少于10例、陽性樣本(應含弱陽性/低擴增的樣本)不少于10例。若無法獲得足量臨床陽性樣本，可對其進行稀釋或使用人工制備樣本（如假病毒顆粒、質粒等）等獲得類似效果；陰性樣本中應包含與檢測對象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀的樣本，如新冠病毒核酸檢測項目，陰性樣本可包含其他冠狀病毒或流感樣本等。

驗證方法：按照患者樣本檢測程序，采用參比方法和候選方法平行檢測，結果可繪制成2×2表，計算符合率。

精密度

樣本：新鮮或凍存的陰性和弱陽性樣本各一份。對于無法獲得足量臨床陽性樣本的項目，可對臨床陽性樣本進行稀釋或使用人工制備樣本（如假病毒顆粒、質粒等）。
驗證方法：每天檢測3-4次，連續檢測5天，陰陽性樣本符合率≥90%。如對新冠病毒核酸檢測項目，其陰陽性樣本的符合率應為100%，同時陽性樣本重復檢測Ct值的變異系數（CV）應＜5%。

檢出限

驗證要求：所用檢驗程序在廠家試劑使用說明書等有聲明檢出限時，檢測項目在有標準物質時，或以定量形式表達定性結果時，應進行檢出限的驗證。
樣本要求：定值標準物質（如：國際參考品、國家參考品、廠家參考品）。對于報告具體基因型的方法，其選用的標準物質需包括所有的突變類型。對于檢測對象同時含有不同比例的不同基因型時，應設置多個梯度，主要從擴增反應終體系總核酸濃度和突變序列所占比例兩個方面進行評價。
驗證方法：使用定值標準物質的樣本梯度稀釋至廠家聲明的檢出限濃度，可重復測定5次或在不同批內對該濃度樣本進行20次重復測定（如測定5天，每天測定4份樣本）。稀釋液可根據情況選用廠家提供的稀釋液或陰性血清，該陰性血清除被驗證的目標物必須陰性外，所含干擾物質濃度必須在廠家聲明的范圍之內。如對于新冠病毒核酸檢測項目，可選用有證的定值標準物質或定值質控品樣本。
判斷標準：如果是5次重復檢測，必須100%檢出靶核酸；如果是20次檢測，必須檢出至少18次靶核酸。

當然，除上述符合率、精密度和檢出限等性能指標外，實驗室也可根據自身情況對試劑說明書中的其他性能指標進行驗證，如交叉反應和抗干擾能力等，不過這并不是強制要求的。

再需提醒各位的是，性能驗證是保證實驗室檢測質量非常重要的一個環節。但正如前面所提及的，有些實驗室準備工作尚未做好就進行性能驗證，如此性能驗證的結果并不可靠。再有不少實驗室性能驗證操作并非本實驗室檢測人員所做，而是由廠家技術人員代為進行。即便廠家所做結果沒有問題，但因實驗室檢測系統中至關重要的人員并未參與其中，這又如何保證本實驗室檢測系統的檢測質量呢？更何況在某些情況下，廠家技術人員可能并不會認真對待性能驗證，而是敷衍了事草草應付。下面放一張我在實驗室驗收時看的一份新冠病毒核酸檢測的性能驗證報告，各位可先看看這個報告是否存在問題？