植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定(考馬斯亮藍(lán)法)
植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝的酶類(lèi)，測(cè)其含量是了解植物體總代謝的一個(gè)重要指標(biāo)。在研究每一種酶的作用時(shí)，常以比活（酶活力單位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制劑純度。因此，測(cè)定植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)是研究酶活的一個(gè)重要項(xiàng)目。常用測(cè)定方法有Lowry法和考馬斯亮藍(lán)G-250染料結(jié)合法。本實(shí)驗(yàn)將分別介紹這兩種方法。
【原理】
考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)G-250在游離態(tài)下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65nm，后者在595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（0～100μg/ml），蛋白質(zhì)－色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比。故可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應(yīng)非常靈敏，可測(cè)微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，所以是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法。
【儀器與用具】
分光光度計(jì)，10ml量筒1支；研體；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度試管14支。
【試劑】
（1）牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml；
（2）考馬斯亮藍(lán)G-250：稱(chēng)取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml。此溶液在常溫下可放置一個(gè)月；
（3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。
【方法】
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
（1）0～100μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作取6支試管，按表28-1數(shù)據(jù)配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。準(zhǔn)確吸取所配各管溶液0.1ml，分別放入10ml具塞試管中，加入5ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，蓋塞，反轉(zhuǎn)混合數(shù)次，放置2min后，在595nm下比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
表28-1配制0～100μg/ml血清白蛋白液
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| 管號(hào) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
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100μg/ml牛血清蛋白量(ml) 蒸餾水量(ml) 蛋白質(zhì)含量(mg) |
0 1.0 0 |
0.2 0.8 0.02 |
0.4 0.6 0.04 |
0.6 0.4 0.06 |
0.8 0.2 0.08 |
1.0 0 0.10 |
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（2）0～1000μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作另取6支試管，按表28-2數(shù)據(jù)配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。與步驟（1）操作相同，繪出0～1000μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
表28-2配制0～1000μg/ml血清蛋白血液
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| 管號(hào) | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
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1000μg/ml牛血清白蛋白（ml） ? 蒸餾水量(ml)? 蛋白質(zhì)含量(mg) |
0 1.0 0 |
0.2 0.8 0.2 |
0.4 0.6 0.4 |
0.6 0.4 0.6 |
0.8 0.2 0.8 |
1.0 0 1.0 |
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2.樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定吸取樣品提取液0.1ml（樣品提取見(jiàn)各酶活測(cè)定），放入具塞刻度試管中（設(shè)兩個(gè)重復(fù)管），加入5ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混合，放置2min后在595nm下比色，記錄吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得蛋白質(zhì)含量。
3.結(jié)果計(jì)算
樣品蛋白質(zhì)含量（mg/g鮮重）=
式中C－查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所得每管蛋白質(zhì)含量（mg）；
V－提取液總體積（ml）；
a－測(cè)定所取提取液體積（ml）；
W－取樣量（g）。
