本文對蘋果酒中有機酸的高效液相色譜(HPLC)進行了系統的研究。優化了色譜柱型、流動相、流速、檢測波長等色譜條件。

1、實驗材料

實驗室制備蘋果酒樣品；L-蘋果酸（色譜純度）；L-乳酸（色譜純度）；L malic酸（分析純度）；甲醇（色譜純度）；甲酸（色譜純度）。

2、實驗儀器

分析天平0.1mg；

漩渦混合器 ；

數控超聲波清洗器 ；

循環式多用真空泵 ；

高效液相色譜儀 ，配紫外檢測器 ；

pH計 。

3、樣品預處理

在室溫下平衡蘋果酒樣品后，用濾紙過濾樣品，然后用0.45μm微孔濾膜過濾，稀釋3.3倍并直接注入。

4、儀器及其條件

色譜柱：C18 （3.5um X4.6mm ×75mm ）；

柱溫：25℃ ；

流動相為甲酸0.1%＋3%甲醇，在使用前用0.45μm混合纖維膜進行真空過濾。

流速 ：0.5mL／min ；

進樣量 ：20ul；

檢測波長：210nm 。

有機酸的表征：將蘋果提取液的色譜圖與蘋果酸和乳酸的標準色譜圖進行比較。根據保留時間對蘋果酒中有機酸的種類進行了初步確定，并加入樣品外標法和譜圖數據進行了輔助定性分析。

有機酸的定量測定：以對羥基苯甲酸和L-乳酸混合標準溶液為母液，稀釋至6的濃度（蘋果酸5000, 4000, 3000，2000, 1000和500毫克/升；乳酸2000, 1500, 1000，500, 200和100毫克/升）。

根據高效液相色譜儀的分析條件，對各濃度梯度的混合樣品進行了檢測，并在每個水平點進行了三次注射，以質量濃度(X，mg/L)繪制了峰面積(Y)，繪制了標準曲線。

5、色譜柱的選擇

在蘋果酒中有機酸的高效液相色譜檢測中，優化有機酸的色譜分離條件，包括色譜柱類型、流動相比、流速、檢測波長等。

液相色譜柱是高效液相色譜分離體系，對混合物中各組分的準確定性和定量分析具有重要的作用。為了使蘋果酒在高效液相色譜中具有良好的分離效果，首先對色譜柱進行了優化。

本實驗選 用了3 種型號的柱子 ，即

①C18柱 ，5um ×4.6mm× 250mm ；

② T3柱，5um × 4.6mm ×250mm；

③ C18柱，3.5um ×4.6mm ×75mm 。

以蘋果酸和乳酸混合標準樣品和自制蘋果酒為研究對象，對三柱的分離效率進行了研究。在相同的洗脫工藝下，對三柱色譜柱進行了測試，在相同的分析時間下，T3柱具有較好的分離效果。考慮到類似的分離效果，C18柱能在短時間內有效分離蘋果酸和乳酸，僅需12分鐘。可以對樣品進行分析。這是因為C18柱(3.5um×4.6mm×75 mm)是一個快速分離柱。該柱的粒徑比普通柱小，為3.5um。與傳統的高效液相色譜法相比，快速分離柱高效液相色譜具有分離時間短、分析速度快、流動相消耗少、分析成本低的優點。為了有效地完成實驗，在各峰分離效果良好的前提下，盡可能縮短了分離所需的時間，然后選用C18(3.5μm，4.6mm，75 mm)色譜柱作為實驗分析柱。