苦杏仁中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的液質聯用檢測分析
黃曲霉毒素（aflatoxins，簡稱AFs）是由黃曲霉、寄生曲霉等產生的有毒次生代謝產物，主要包括黃曲霉毒素B1（AFB1），B2（AFB2），G1（AFG1），G2（AFG2），具有嚴重的致癌、致畸、致突變等作用，危害巨大，其中AFB1在1993年被世界衛生組織癌癥研究機構（IARC）劃定為Ⅰ類致癌物[1-2]。對此，《中國藥典》2010年版一部收錄了桃仁、胖大海等五味中藥中AFB1，AFB2，AFG1，AFG2的高效液相色譜熒光檢測方法[3]，并規定AFB1最高限量為5 μg·kg1，AF（B1+B2+G1+G2）最高限量為10 μg·kg1，但并未對苦杏仁等其他易霉變的藥材制訂相關的限量標準。?
苦杏仁Semen Armeniacae Amarum為薔薇科植物山杏、西伯利亞杏、東北杏或杏的干燥成熟種子，具有降氣止咳平喘，潤腸通便等功效[4]。與桃仁相似，苦杏仁富含淀粉、油脂類等成分，易因貯藏、處理等過程中的操作不當而引發霉變，進而污染真菌毒素。本課題組前期也發現苦杏仁極易發生霉變，且污染AFB1的幾率遠高于其他中藥材[5-6]。因此，為了保障患者的健康，推動中國藥典對苦杏仁進行相關限量標準的規定，有必要對其污染黃曲霉毒素的情況進行進一步的調查研究。?
液質聯用技術（LC-MS/MS）具有選擇性高、靈敏度好、多組分同時檢測等優點，近年來被廣泛用于真菌毒素的研究，在中藥真菌毒素檢測方面顯示了很好的應用前景[7-9]。由于中藥成分復雜，產生的基質效應成為影響LC-MS/MS法檢測準確度的主要因素，目前國內對中藥材真菌毒素的LC-MS/MS檢測多側重于采用免疫親和柱或多功能凈化柱的方法進行樣品純化，但其純化效果容易受樣品基質、pH、溶劑、鹽濃度等的影響，同時各種純化柱的價格昂貴，無法重復使用，檢測成本高[10]，無法滿足對大量藥材進行篩查的需求。?
本研究旨在采用稀釋法，并通過優化色譜和質譜條件，從而達到減少基質效應影響的目的，建立一套不需經過復雜、昂貴的純化步驟即可對苦杏仁污染的AFB1，B2，G1，G2同時進行定性定量檢測的LC-MS/MS方法，實現其經濟、快速、高通量的篩查，為進一步完善中藥的安全性評估提供參考。?
1 材料?
TSQ Quantum Access液相色譜-串聯三重四級桿質譜儀，帶Xcalibur 2.0操作軟件（美國，Thermo）；氮吹儀（美國，caliper）；臺式冷凍離心機（德國，Sartorius）；VXR渦旋振蕩器，帶VX8配件（德國，IKA）；pH計（美國，Thermo）；1/1萬電子分析天平（德國，Sartorius）。?
黃曲霉毒素混合對照品溶液，含AFB1 1.039 mg·L-1，AFB2 0.314 0 mg·L-1，AFG1 1.056 mg·L-1，AFG2 0.288 0 mg·L-1（批號LB96951），購自美國SUPELCO公司。甲醇、乙腈（色譜純，德國，Merck）；醋酸銨、甲酸（色譜純，美國，DikmaPure）；真菌毒素多功能凈化柱Mycosep226（美國，Romer）；實驗所用超純水由Millipore Q純凈水設備（法國，Millipore）制得。?
11份苦杏仁樣品各100 g，分別購自廣州地區的藥店、藥材市場和醫院，經廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心詹若挺研究員鑒定為正品，樣品購買后置密封袋中獨立包裝，于真空干燥器中保存備用。?
2 方法?
2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil GOLD C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）（美國，Thermo）；流動相A-甲醇，B-4.0 mmol·L-1醋酸銨-0.1%甲酸水溶液（pH 3.0）；梯度洗脫（0～5 min，20% A；5～20 min，20%～80% A）。流速0.3 mL·min1；柱溫30 ℃；樣品溫度4 ℃；進樣體積10 μL。 2.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子化源（ESI）；噴霧電壓3 500 V（+）；鞘氣、輔助氣壓力均為690 kPa（N2），流速分別為13.3 L·min1和5 L·min1；離子傳輸毛細管溫度350 ℃；選擇反應監測模式（SRM）檢測，并采用切換閥保護質譜，0～10 min洗脫液切換至廢液。4種黃曲霉毒素SRM檢測的相關質譜參數見表1。?
2.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末（過3號篩）2.0 g，精密稱定，置于50 mL離心管中，精密加入10 mL 84%乙腈，浸泡20 min后500 r·min1渦旋10 min混勻，然后在1 500 r·min1轉速下提取60 min，樣品于4 ℃，5 000 r·min1下離心5 min，再取250 μL上清液氮氣吹干（室溫），殘渣精密加入1 mL甲醇溶解，最后用0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。?
3 結果與分析?
3.1 專屬性試驗 分別取苦杏仁的陰性樣品溶液、四種黃曲霉毒素的標準品溶液和陽性樣品溶液，按2.1項下方法進行檢測，記錄色譜圖，結果見圖1。由圖中可知，AFG2，G1，B2，B1的保留時間分別為14.23，15.11，15.91，16.62 min，陰性樣品在各化合物的RT未見干擾。?
3.2 線性關系考察 取黃曲霉毒素對照品溶液，用色譜甲醇以25，50，125，250，1 250，2 500，12 500，25 000，125 000倍稀釋，按上述色譜、質譜條件進樣分析，以進樣濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），權重W=1/X2，使用Xcalibur 2.0計算線性方程。結果見表2，可見4種黃曲霉毒素在各自濃度范圍內具有良好的線性關系。?
3.3 檢測限（LOD）及定量限（LOQ） 取梯度稀釋的對照品溶液，按上述色譜質譜條件注入液質聯用儀進行分析，以3/1和10/1的信噪比分別測得四種黃曲霉毒素的LOD和LOQ，結果見表2。?
3.4 日內、日間精密度試驗 平行取苦杏仁（未污染）粉末3份，每份2.0 g，按2.3項下方法制備供試品溶液，添加特定濃度的對照品溶液，配制成低、中、高3個濃度水平的加標溶液（AFB1，B2，G1，G2的質量濃度依次為0.416，0.126，0.422，0.115；4.16，1.26，4.22，1.15；12.48，3.78，12.66，3.45 μg·L-1），每個濃度各3份，每份樣品重復測定2次，連續測定3 d，根據峰面積結果進行方差分析，計算方法的日內精密度和日間精密度。結果顯示4種黃曲霉毒素3個濃度水平的日內精密度RSD為1.6%～6.8%，日間精密度RSD為2.3%～6.6%，表明儀器的精密度良好。?
3.5 重復性試驗 平行取苦杏仁（未污染）粉末9份，每份2.0 g，按照低、中、高3個濃度水平（AFB1，B2，G1，G2的具體濃度與3.4項一致，相當于生藥質量濃度依次為8.320，2.520，8.440，2.300；83.20，25.20，84.40，23.00；249.6，75.60，253.2，69.00 μg·kg1）添加黃曲霉毒素對照品溶液，待溶劑揮干后，按2.3項下方法制備供試品溶液，進樣分析，根據各濃度峰面積的方差分析，計算方法的重復性。結果見表4，可知4種黃曲霉毒素在3個濃度水平的重復性RSD為2.2%～8.6%，表明方法的重復性良好。?
3.6 基質效應考察 按3.4項下方法配制的低、中、高3個濃度的加標溶液，各3份；再用色譜甲醇配制相同濃度的對照品溶液，每個濃度各3份，進樣分析，按照以下公式[11]計算2組峰面積的比值，考察苦杏仁的基質效應，結果見表3，表明基質效應的影響可忽略不計。?
3.7 回收率試驗 平行取苦杏仁（未污染）粉末12份，每份2.0 g，其中3份作為空白對照，另外9份按3.5項下方法制備得低、中、高3個濃度的溶液，每個濃度各3份，進樣分析，峰面積記為A；另外取苦杏仁（未污染）粉末3份，每份2.0 g，按3.4項下方法配制成低、中、高3個濃度的加標溶液，每個濃度各3份，進樣分析，峰面積記為B；再用色譜甲醇配制相同濃度的標準品溶液，每個濃度各3份，進樣分析，峰面積記為C；按照以下公式[11]計算提取回收率RE與絕對回收率RA，結果見表4。?
RE=A/B ×100%；?
RA=A/C×100%?
3.8 方法比較 平行取苦杏仁（未污染）粉末12份，每份2.0 g，其中3份作為空白對照，另外9份按3.5項下方法制備后，取6 mL上清液放入玻璃試管內，Mycosep226柱進行純化[7]（具體操作參照廠家說明），再取250 μL洗脫液氮氣吹干，定容，得低、中、高3個濃度的溶液，每個濃度各3份；另外取苦杏仁（未污染）粉末3份，每份2.0 g，按2.3項下方法制備，取6.0 mL上清液放入玻璃試管內，Mycosep226柱進行純化（具體操作參照廠家說明），再取250 μL洗脫液氮氣吹干，按3.4項下方法配制成低、中、高3個濃度的加標溶液，每個濃度各3份；再用色譜甲醇配制相同濃度的標準品溶液，每個濃度各3份；進樣分析，分別計算3組樣品的峰面積，按照3.7項下公式計算本方法的RE與RA，并與3.7項下的結果進行比較，分析2種方法的差異。結果如表4，可見回收率不純化>回收率Mycosep226純化，表明本研究建立的方法回收率更高，損失率更低。 3.9 樣品測定結果 分別取收集自廣州地區的藥店、藥材市場和醫院的11批苦杏仁藥材樣品各2份，每份2.0 g，按前述方法進行樣品制備和分析，結果見表5。?
4 討論?
基質效應是由于樣品共流組分對目標化合物離子化效率的影響而引起的，是導致LC-MS/MS定量的不準確的主要影響因素[12]。因此，基質效應的評價在方法學驗證階段尤為重要。減少基質效應主要有以下方法[12]：優化樣品前處理技術，比如各種凈化柱純化；稀釋樣品，降低干擾成分濃度；優化提取溶劑、定容溶劑，提高質譜對目標物的響應；提高色譜分離度，減少共流組分的影響等方法。但目前國內報道的中藥材中真菌毒素的LC-MS/MS檢測多側重于樣品的前處理技術這一方面，即采用免疫親和柱或多功能凈化柱純化樣品，然而這些方法操作較繁瑣，檢測成本高，嚴重限制LC-MS/MS方法的大范圍應用。?
因此，本研究根據上述減少基質效應的方法，采用稀釋法，比較并優化了各種流動相（0.1%甲酸水溶液與甲醇、4.0 mmol·L-1醋酸銨-0.1%甲酸水溶液與甲醇、4.0 mmol·L-1醋酸銨-0.2%甲酸水溶液與甲醇）、洗脫梯度、定容溶劑（流動相、甲醇）等條件，從而提高黃曲霉毒素的響應。最終采用提取后添加法[11]對苦杏仁在低、中、高3個濃度點進行了基質效應考察，實驗結果表明，本研究的方法已成功克服基質效應對整個LC-MS/MS定量分析過程的影響，從而可用于苦杏仁中AFB1，B2，G1，G2快速、準確的檢測。?
同時，通過比較本方法與Mycosep226凈化柱的效果，發現2種方法的RA和RE有明顯的差異，Mycosep226凈化柱純化后各黃曲霉毒素的回收率均有一定程度降低，說明使用該凈化柱純化的方法會導致目標化合物的損失，這對微量殘留的黃曲霉毒素檢測極為不利。而本方法不存在以上缺點，且提取、檢測過程簡便，不僅節省了檢測的成本，更提高了結果的準確性，從而可用于苦杏仁的大量篩查。?
本實驗收集的苦杏仁藥材共3種：燀苦杏仁（去種皮）、炒苦杏仁（去種皮）、苦杏仁（未去種皮），檢測結果顯示3份去種皮的苦杏仁中有2份已污染黃曲霉毒素，而其他未去種皮的苦杏仁均未見污染，推測原因可能是苦杏仁去種皮后種仁的營養物質（油脂、淀粉）完全暴露，更容易被真菌侵染，從而增加污染黃曲霉毒素的風險。因此，苦杏仁污染黃曲霉毒素的這一現象應當引起重視，并且有必要考察其合適的貯藏方式和條件，以降低污染的風險，同時，及早建立相關的限量標準也將有利于降低黃曲霉毒素對消費者的危害性。?
本研究為中藥材污染黃曲霉毒素的快速檢測提供了新的研究思路：通過降低基質成分濃度、優化色譜、質譜條件，減少干擾成分的共流出，有可能克服中藥材基質對LC-MS/MS檢測的影響，不需昂貴的凈化柱即可實現藥材的篩查與檢測。?
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