糖化血紅蛋白A1c（hemoglobin A1c，HbA1c）是評價糖尿病血糖控制水平的首選指標，并且與糖尿病慢性并發癥的發生和發展密切相關。近年來，許多國家糖尿病學會和WHO推薦將其作為糖尿病的首選診斷標準，拓寬了HbA1c的應用范圍。然而在某些特定的情況下，尤其是當病人有血紅蛋白變異體存在時常導致HbA1c測定結果的極度異常或與血糖水平不一致，甚至誤導臨床；而且多種因素可致HbA1c出現假性升高或降低，不能準確反映糖尿病病人血糖控制狀況，影響臨床診斷和治療。本文簡要討論糖化血紅蛋白的生物化學特性，重點介紹糖化血紅蛋白的測定方法、血紅蛋白變異體對HbA1c測定的干擾，以及引起HbA1c假性升高或降低的因素，并提出實驗室檢測注意事項。

一、HbA1c的生物化學

成人血紅蛋白（hemoglobin，Hb）通常由HbA（97％）、HbA2（2.5%）和HbF（0.5%）組成。在健康人，幾乎94%的HbA是非糖化的血紅蛋白即HbA0，而6%的是糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin,GHb）即HbA1。HbA1又包括HbA1a、HbA1b 和HbA1c，前二者含量較少約占GHb的1%，HbA1c是主要的糖化血紅蛋白，約占GHb的5%。HbA1a又由HbA1a1和HbA1a2組成，兩者分別是血紅蛋白β鏈N-末端與1，6-二磷酸果糖和6-磷酸葡萄糖發生糖基化作用的產物，HbA1b是血紅蛋白β鏈N-末端與丙酮酸的結合物，HbA1c由葡萄糖與血紅蛋白β鏈N-末端的纈氨酸殘基縮合而成。

HbA1c的形成主要依賴血糖濃度和紅細胞壽命。全部過程經歷兩個非酶促反應：第一步是快速反應期，葡萄糖粘附在血紅蛋白N-末端的纈氨酸殘基上，形成一個不穩定的醛亞胺中間產物即Schiffs堿；第二步是Schiffs堿經歷漫長的葡糖胺（Amadori）重排反應形成穩定的酮胺化合物即HbA1c；或逆向轉變成葡萄糖和血紅蛋白。由此可以看出，HbA1c與血液中葡萄糖濃度密切相關，因紅細胞的平均壽命是120d，理論上HbA1c可反映過去120d血糖的平均水平，但在紅細胞120d壽命中，近期血糖水平對HbA1c的檢測值貢獻更大，標本采集前30d的影響達50%，而采前集第31～90d的影響為40%，而91～120d的影響僅為10%，因此，HbA1c檢測主要反映過去2～3月的平均血糖水平。

紅細胞壽命受基因學、血液學和相關疾病等因素的影響，當解釋臨床結果時必須考慮這些因素，特別是能改變紅細胞生成和紅細胞結構的因素，臨床醫生應知曉這些因素可能導致HbA1c假性升高或降低。

二、HbA1c的測定方法

目前，市場上供實驗室選用的測定HbA1c 的方法至少有3 0 余種，主要分為兩大類：一類是基于糖化與非糖化血紅蛋白所帶電荷不同，目前常用的有離子交換層析法（high performance liquid chromatography，HPLC）和毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）；另一類是基于糖化與非糖化血紅蛋白的結構差異，這一類包括免疫測定法（immunoassays，IA）、酶法（Enzymatic assays，EA）和親和層析法（affinitychromatography，AC）。不同方法采用的原理不同，所測組分不同，但均可以按照國際臨床化學和檢驗醫學聯合會（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）的參考測量程序進行標化。

（一）基于電荷差異的測定方法

1.陽離子交換HPLC法：是國內外最常用的分析方法，以Bio-Rad和TOSOH等廠商生產的糖化血紅蛋白分析系統為代表。其基本原理是：糖化與非糖化血紅蛋白所帶電荷不同，對陽離子交換樹脂（帶負電荷）的吸附能力不同，選擇洗脫緩沖液的離子強度與pH，不同組分的血紅蛋白HbA1a、HbA1b、HbF、HbA1c、HbA0和HbA2依次被洗脫，得到血紅蛋白各組分的層析圖譜。樣本中HbA1c的濃度可用下式計算：GHb（HbA1c）% =GHb（HbA1c）/ΣHbA，ΣHbA包括糖化的和未糖化的HbA各組分。HPLC法最突出的優點是具有優良的精密度，而主要缺點是易受血紅蛋白變異體的干擾導致HbA1c假性升高或降低。

2.CE法：這是近年來發展起來的一種新技術，以法國Sebia公司的CAPILLARY 2 FP毛細管電泳儀為代表，其基本原理是：不同蛋白質分子在特定pH值緩沖液中所帶電荷不同，通過高電壓，在電滲流和電場力作用下的泳動速率也不同，從而使糖化和非糖化血紅蛋白得以完全分離，從陰極到陽極依次為HbA2/HbC、HbES/HbD、HbF、HbA0、其他血紅蛋白（包括少量HbA2）和HbA1c，按下式計算出HbA1c含量：HbA1c（%）=HbA1c/（HbA1c+HbA0）。該法具有良好的精密度和正確度，不受常見血紅蛋白變異體的干擾，而且可以用毛細血管血進行測定。

（二）基于結構差異的測定方法

1.IA法：包括免疫比濁法和膠乳凝集抑制法。該法利用抗原抗體的特異性結合反應測定GHb，以Hbβ鏈糖基末端最初的3～5個氨基酸殘基作為抗體識別位點，制備相應的單克隆抗體。免疫測定法的優勢是可在普通的生化分析儀上完成，快速簡便，易于批量檢測，臨床應用廣泛。其主要缺點是不精密度相對較大，常見血紅蛋白變異體可影響檢測結果。

2.EA法：樣本溶血后在蛋白酶的作用下釋放出糖化纈氨酸，同時通過測定Hb的吸光度，求出血紅蛋白濃度。糖化纈氨酸在果糖纈氨酸氧化酶的作用下生成過氧化氫，后者在辣根過氧化物酶催化下與色素原反應產生顏色變化，顏色的深淺與HbA1c濃度成正比。此法適用于各種自動化分析儀。2014年，雅培公司使用果糖基二肽氧化酶在Architect生化分析儀上建立了一種新的HbA1c酶測定法，該法批內和日間CV均小于1.2%，線性范圍達19mmol/mol(3.9%)～163mmol/mol(17.1%)，與HPLC法有很好的相關性，結果與IFCC法一致，氨基甲酰血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素等不干擾測定。

3.AC法：該方法測定的是總GHb，包括HbA1c和酮胺結構。凝膠柱中的瓊脂糖被羰基二咪唑激活后與間氨基苯硼酸相連，而硼酸可與整合在Hb上的順位二醇作可逆性結合，因此GHb與親和樹脂結合，再用反式多元醇配體-山梨醇洗脫，通過檢測415nm波長處的吸光度值來量化糖化和非糖化成分。該法不受血紅蛋白變異體、HbF和氨基甲酰血紅蛋白的干擾，對于血紅蛋白變異體攜帶者長期以來一直被當作參考方法。John等對基于HPLC硼酸鹽親和層析原理的Trinity Biotech Premier Hb9210糖化血紅蛋白分析儀的分析性能進行了多中心評價，參加的實驗室多數為IFCC和NGSP參考實驗室網絡成員，以SI單位表示時，HbA1c低、中、高值的變異系數CV分別為2.71%、2.32% 和2.14%，若以NGSP單位表示則分別為1.62%、1.59% 和1.68%，均明顯低于IFCC推薦的上限3%和NGSP的上限2%，具有較寬的分析測量范圍，與目前常用的HbA1c測定方法以及IFCC參考方法之間均具有很好的相關性，常見的血紅蛋白變異體HbC、HbS、HbE和HbD不干擾測定。

（三）POCT測定法

在過去的幾年中廣泛使用POCT的方法測定HbA1c，POCT法主要基于親和層析分離或免疫測定法的原理。POCT的優點在于可在操作者辦公室手指采血并且能夠給病人和操作者迅速反饋結果及時調整治療方案，主要缺點是重復性差，與參考方法的偏差較大，不同批號的結果一致性差，而且基于免疫學原理的POCT法受血紅蛋白變異體的干擾。總之，POCT 的質量目前尚難保證，其檢測性能不足以滿足臨床需求。使用POCT的操作者應確保其檢測結果與NGSP認證實驗室有可比性。

（四）測定方法的標準化

HbA1c 檢測方法眾多，結果差異較大。為了解決HbA1c 檢測結果的溯源性和可比性，美國（National Glycohemoglobin Standardization Program, NGSP）于1996年開始致力于GHb的標準化研究工作，要求全美臨床實驗室的檢測結果均應溯源至美國糖尿病控制和并發癥臨床試驗（Diabetes Control and Complications Trial，DCCT）和英國糖尿病前瞻性研究（the United Kingdom Prospective Diabetes Study，UKPDS）的研究結果上，指定在DCCT和UKPDS研究中所使用的Bio-Rex 70樹脂HPLC法為參考方法。通過NGSP認證的實驗室，HbA1c水平至少有0.5%的變化被認為是具有統計學和臨床意義。目前，美國絕大多數實驗室的檢測結果均可溯源至DCCT，實現了HbA1c檢測結果具有可比性的目標。

與此同時，1995年，IFCC成立了一個工作組致力于糖化血紅蛋白標準化的研究工作，首先完成了HbA1c的定義，然后基于新的定義研制了校準品，并建立了參考方法，這種新方法已經被包括歐洲、美國、日本、中國在內的10余家IFCC國際參考實驗室驗證。NGSP的HbA1c測定結果以百分數報告，而IFCC結果使用國際單位（International System of Units，SI）報告，即以mmol A1c/molHbA來表示。NGSP和IFCC的值呈線性關系，使用主回歸方程兩個系統的值可以相互轉換。ADA、歐洲糖尿病研究會（EASD）和國際糖尿病聯盟（IDF）等發表了一致性聲明，要求同時使用NGSP（%）和IFCC（SI）單位報告結果。

IFCC的新定義是：人體血液中的葡萄糖與血紅蛋白β鏈N-末端纈氨酸殘基以共價鍵結合的穩定的已糖化合物，全稱為血紅蛋白β鏈-N-1-脫氧果糖-血紅蛋白。新的定義排除了葡萄糖與血紅蛋白β鏈賴氨酸殘基以及與血紅蛋白α鏈任一氨基酸的結合物。而通常所說的GHb是指一個或更多個糖分子不可逆地結合在血紅蛋白任一蛋白鏈的任一氨基酸上，包括HbA1c。IFCC參考方法包括與內蛋白酶Glu-C共孵育、清除β鏈氮端的六肽、用質譜法或毛細管電泳法分離、定量糖基化以及非糖基化的六肽。參考物質為人血液中提取的純化HbA1c和 HbA0混合物。

三、血紅蛋白變異體對HbA1c測定的干擾

（一）常見的血紅蛋白變異體

迄今發現最為常見的血紅蛋白變異體是HbS、HbE、HbC和HbD，全球范圍的分布規律為HbS＞HbE＞HbC＞HbD，這四種變異體均由血紅蛋白β鏈一個氨基酸被替換而生成。HbS即鐮形紅細胞血紅蛋白，β鏈第6位的谷氨酸突變為纈氨酸，純合子攜帶者表現為嚴重的鐮形紅細胞貧血。HbE是位于β鏈第26位的谷氨酸突變為賴氨酸，純合子攜帶者通常無貧血癥狀。HbC系位于β鏈第6位的谷氨酸突變為賴氨酸；純合子攜帶者通常血紅蛋白含量正常或有輕度貧血，HbSC攜帶者常有輕至中度的慢性溶血性貧血。HbD是位于β鏈第121位的谷氨酸突變為谷氨酰胺，其攜帶者常有輕度溶血性貧血。大部分血紅蛋白變異體的雜合子通常無癥狀，紅細胞生存率正常，如果糖尿病患者同時攜帶血紅蛋白變異體基因，不易引起臨床醫生的注意。

（二）血紅蛋白變異體對HbA1c測定的干擾

1. 陽離子交換HPLC法：通常HPLC法最易受血紅蛋白變異體的干擾，這種干擾可能引起HbA1c的極度異常或HbA1c測定值與血糖濃度不一致。在使用HPLC法時，由于血紅蛋白變異體與HbA1c共洗脫可導致HbA1c假性升高產生極度異常結果，例如：HbI變異體與HbA1c共洗脫可致HbA1c升高至25%以上，HbK Woolwich、Hb Hope、Hb Camden等變異體與HbA1c共洗脫可致HbA1c升高至45%以上。很多變異體的形成是α或β鏈的一個中性氨基酸被一個帶正電荷的基團取代，這種改變降低了非糖化血紅蛋白變異體的洗脫時間，使其與HbA1c一起洗脫，導致HbA1c的檢測值假性升高，甚至高達54%，如Hb Raleigh、Hb Graz、Hb Sherwood Forest、Hb South Florida等。若血紅蛋白變異體的突變發生在氨基端則使得乙酰化血紅蛋白在體內更容易形成，乙酰化HbA在某些方法中與HbA1c一起洗脫，使用這些方法檢測時也會導致HbA1c假性偏高。在某些情況下，血紅蛋白變異體與HbA共洗脫，但糖化的變異體與HbA1c完全分離，從而導致HbA1c假性降低，如HbD、Hb G philadelphia、Hb J Baltimore、Hb Opadove等。迄今為止，已發現對HPLC法干擾的血紅蛋白變異體至少有27種。而最常見的血紅蛋白變異體對大多數方法不產生干擾，NGSP網頁含有更新血紅蛋白變異體對不同方法干擾的信息，臨床和實驗室人員可隨時查閱。

通常Hb變異體與HbA1c一起洗脫或是分離取決于使用的方法。這些不一致的結果的產生是因為使用了不同的溶液、分析柱、溫度、壓力、流速、洗脫時間。因此同一變異體使用不同方法得出的HbA1c結果可能存在很大差異。

2. IA法：由于HbS和HbC的突變位點靠近β鏈的氨基末端，一些基于免疫學原理的分析方法如雅培Architect/Aeroset系統、貝克曼AU系統、西門子Advia系統等會受這兩種變異體干擾，而HbE和HbD的突變位點距β鏈氨基端較遠，不影響免疫學方法。當有HbK Woolwich、Hb Hope、Hb Camden等變異體存在時，免疫測定法受這些變異體的干擾使HbA1c測定值低于4%，與血糖濃度不一致，其原因可能是變異血紅蛋白干擾變異體β鏈與抗體的結合。其它變異體如Hb Graz、Hb Raleigh、Hb Raleigh也可使免疫法的結果假性降低。免疫測定法易于受HbF的干擾，其原因是定量測定HbA1c的大多數抗體識別的是血紅蛋白β鏈N-末端第5或6位糖化氨基酸，而HbF在這些位點的氨基酸組成發生了改變，因此抗體不能識別糖化的HbF，而定量總血紅蛋白的試劑能同時測定HbA和HbF，故導致HbA1c假性降低。

3.AC法：由于硼酸鹽親和層析法可將糖基化血紅蛋白與非糖基化血紅蛋白分離，與血紅蛋白的種類無關，通常不受血紅蛋白變異體及其衍生物的干擾，因此在評價血紅蛋白變異體對某一方法的干擾時常作為參比方法。有研究報道使用Abbott IMX系統測定HbAC樣本時HbA1c有正向偏倚，該系統使用的是硼酸鹽/陽離子捕獲法，推測導致該偏倚的原因可能系聚陰離子捕獲試劑與非糖化HbC分子6號位的賴氨酸替換發生反應所致。

4.CE法：迄今為止，尚未發現Schiffs堿，氨基甲酰血紅蛋白，常見的血紅蛋白變異體如HbS、HbD、HbC、HbE，升高的HbA2和HbF對HbA1c測定有干擾。Dessi等對6例HbAS雜合子的HbA1c檢測結果顯示，毛細管電泳法與Variant ⅡHPLC法結果一致，但G8 HPLC法明顯降低；此外，1例HbD變異體患者VariantⅡ法HbA1c測定值為681mmol/mol（97.3%），使用相同的分析儀器但校準品、質控品、運行時間和分析軟件不同，測定結果為76mmol/mol（10.8%），而毛細管電泳法和G8法分別為75mmol/mol（10.7%）和48mmol/mol（6.8%）。結果提示，當有血紅蛋白變異體存在毛細管電泳法的結果更可靠。

四、引起HbA1c假性升高或降低的其他因素

（一）HbA1c假性升高

任何延長紅細胞壽命或減少紅細胞在高糖環境中暴露時間的因素均可引起HbA1c水平增高，缺鐵性貧血（iron deficiency anemia，IDA）是最常見的引起HbA1c增高的因素。研究證明，與OGTT相比，HbA1c對IDA伴有糖尿病的病人診斷特異度明顯降低。先前的研究顯示，伴有和不伴有糖尿病的貧血病人經治療后HbA1c明顯降低，但最近的研究表明，伴有DM的IDA病人經治療后HbA1c明顯升高，其確切的機制尚需進一步研究。其他引起HbA1c假性升高的情況還包括維生素B12和葉酸缺乏性貧血、無脾癥等。

嚴重的高甘油三酯血癥（濃度＞1750mg/dL）、嚴重的高膽紅素血癥（濃度＞20mg/dL）和尿毒癥均可引起HbA1c假性升高。當實驗室的組合中有其中一項并包括HbA1c測定時，臨床醫師應考慮作出標記標明HbA1c測定結果不可靠，以避免將來參考此結果時引起誤導。

數種治療藥物和化學物質可引起HbA1c假性升高，包括鉛中毒、長期飲酒、服用水楊酸鹽和阿片類藥物。當用電泳法測定HbA1c時，服用維生素C可引起HbA1c假性升高，而使用色譜法時則引起HbA1c假性降低，此可能是通過競爭機制抑制了糖基化作用所致。盡管在每天攝入維生素C 1g，持續3個月時可以看到這種影響，這也是多數病人的常規劑量，但其研究對象為非糖尿病病人，因此臨床關聯性還不清楚。

（二）HbA1c假性降低

任何能縮短紅細胞壽命或減少紅細胞在高糖環境中的暴露時間，增加紅細胞周轉的因素均可造成HbA1c水平降低，這些因素如急性或慢性失血、溶血性貧血、脾臟腫大等均可造成HbA1c結果假性降低。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）缺陷可導致糖化血紅蛋白降低，也有研究報道，G-6-PD缺陷是2型糖尿病的風險因素之一。

通常，慢性腎病的病人HbA1c結果假性降低。這最初是由于隨著紅細胞生存的減少引起的慢性貧血有關，然而，包括促紅細胞生成素治療和高尿素血癥的存在等多種因素的相互作用產生不同的效果進一步影響HbA1c。總之，在終末期腎病的病人，傾向于低估病人的平均血糖濃度，臨床醫生應考慮使用血糖控制的替代指標。在妊娠初期，HbA1c不能真實地反映血糖水平，因為紅細胞壽命由約120d減少到90d左右，同時促紅細胞生成素產生增加。HbA1c值在孕12-16周進一步降低，直到孕20-24周停止。HbA1c水平在妊娠9個月又重新開始升高。因為在妊娠期間HbA1c水平通常假性降低，故不能用于診斷妊娠糖尿病。反而，OGTT試驗可以用來篩查和診斷，在妊娠期間的血糖管理應首先確定使用自我血糖監測。影響HbA1c假性降低的補充品和治療藥物包括維生素E、病毒唑和α-干擾素。維生素E每天劑量達到600-1200mg即可減少蛋白質的糖化作用，而病毒唑和α-干擾素能夠引起可逆的溶血性貧血。