蔣　敏1 , 賈文祥3 , 陳　嵐1 , 周　偉1 , 李文勝1 , (1. 四川大學華西第二醫院, 四川成都610041 ; 2. 四川大學華西醫院, 四川成都610041 ; 3. 四川大學華西基礎醫學與法醫學院, 四川成都610041)

摘要: 目的　建立一種多重PCR 方法,在同一擴增體系內同時檢測淋病奈瑟球菌及其青霉素、四環素耐藥基因, 探討采用多重PCR 同時檢測淋菌及其耐藥基因的可行性。方法　根據淋菌CPPB、TeM21、Tet2M基因序列,分別設計了3 對引物,并在同一擴增體系內行PCR 擴增,擴增的靶序列分別為150 bp 、224 bp 、316 bp 。結果　淋菌及其青霉素、四環素耐藥的標準菌株,上述3 個基因位點的檢測均為陽性,對125 例臨床標本同時進行傳統培養、藥敏和多重PCR 檢測,結果顯示淋菌的檢出率:培養法為20. 0 % ,PCR 法為24. 8 %;PPNG檢出率:藥敏法為16. 0 % ,PCR法為20. 8 ;TRNG檢出率:藥敏法為14. 4 % ,PCR 法為19. 2 %。結論　該法與傳統的培養及藥敏試驗相比具敏感、特異、迅速、標本不受淋菌存活以及藥敏試驗諸多因素的影響,是一種簡便、快速、可靠的方法。 關鍵詞: PCR; 淋病奈瑟球菌; 耐藥基因 中圖分類號: R759. 2 　　文獻標識碼: A 　　文章編號: 100524529 (2005) 0120023203

　自20 世紀80 年代以來,淋病已成為我國發病率較高的性傳播疾病,而淋病奈瑟球菌(簡稱淋菌)的耐藥性日益增多,給淋病治療帶來新的問題。淋菌對抗生素的耐藥性可由質粒、染色體或二者共同介導1 。自1976 年和1985 年美國等先后分離出耐青霉素淋菌(PPNG) 和高度耐四環素淋菌(TRNG) 以來,許多國家都有大量文獻報道淋菌及耐藥性問題。雖然青霉素和四環素不再作為治療淋病首選藥物,但PPNG、TRNG的檢測仍是淋菌耐藥性流行病學監測中的重要指標之一,傳統的方法主要靠培養鑒定及藥敏試驗,步驟復雜,周期長,易受標本采集、運輸、保存以及患者病情、治療情況等因素影響,不利于PPNG、TRNG株的快速檢出和淋病的早期診斷和治療。1994 年,Ogunrinu 報道了用兩對引物在同一擴增體系內同時檢測淋菌和耐青霉素基因,郭露等2 建立了淋菌TRNG 株的PCR 檢測方法,陳斌等3 采用兩對引物套式PCR 檢測PPNG,我們在此基礎上進行了進一步探討,即用3 對引物在同一擴增體系內同時檢測淋菌及耐青霉素基因(TeM21) 、耐四環素基因(Tet2M) ,并與傳統培養和藥敏法進行比較,為臨床早期快速檢測淋菌及其耐藥性研究提供依據。 1 　材料與方法 1. 1 　材料 1. 1. 1 　菌株來源　臨床分離與鑒定的淋菌雙重耐藥菌株由四川大學華西醫院皮膚科性病實驗室和我院性病門診患者泌尿生殖道分泌物中分離得到,標準菌株A、B、C 由四川省皮膚病研究所提供。 1. 1. 2 　培養基和藥敏　淋菌培養基為廣州樂通泰公司提供,青霉素及四環素藥敏紙片為法國生物梅里埃公司提供。 1. 1. 3 　PCR 試劑 　由成都進取公司提供,引物由北京賽百盛公司合成,PCR 擴增儀為美國PE 公司的PE9600 ,3 對引物設計分別為: 第1 對引物: 淋菌CPPB 基因,擴增產物150 bp , 5′-CATTGCCCAACGTGCCGACCT-3′ 5′-GAGACTTTGACCCGACAGAAGAC-3′ 第2 對引物: TeM21 基因,擴增產物224 bp ,耐青霉素 5′-GATGCTGAAGATCAGTTGGGT-3′ 5′- GTGACTGGTGAGTACTCAAA-3′ 第3 對引物: Tet2M基因,擴增產物316 bp ,耐四環素 5′-GGATTGATAACCTTATAGAAGT-3′ 5′- TTTGTATCTCCAAGAACACTAT-3′